Transwell侵袭实验

一、实验原理

将Transwell小室放入配套培养板中，形成由细胞可穿透性膜分隔开的两室系统，并将高营养液与低营养液分隔开，为进行侵袭实验，在膜上室铺基质胶（用由细胞外基质组成的凝胶堵塞膜中的孔，该凝胶旨在模拟肿瘤细胞在体内侵袭过程中遇到的典型基质），通过将细胞放置在凝胶的一侧，将趋化剂放置在凝胶的另一侧，侵袭细胞将降解邻近基质并迁移通过ECM凝胶（基质降解与定向运动相结合，即侵袭），从而通过计数穿过细胞以检测细胞侵袭能力。

由于Matrigel胶内含有层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、硫酸肝素糖蛋白、触角蛋白、TGF2β及生长因子等人体ECM的大多数成分，类似动物的基底膜。因此，可模拟最真实的体内环境，体外检测细胞的侵袭性，间接反映体内肿瘤侵袭的能力。

请注意，该结构不是纤维蛋白，而是更偏向凝胶样

二、实验步骤

1. 实验准备

提前12 h将Matrigel放到4℃融化，将实验用到的枪头、EP管等材料提前放到-20℃预冷；实验前准备冰盒，整个实验操作过程置于冰上进行；

2. 包被基底膜

在冰上将Matrigel胶用无血清的细胞培养基进行稀释，混匀后加入小室中，注意动作轻柔，不要产生气泡，将小室放入CO2培养箱中孵育2h备用；

3. 水化基底膜

将孵育完成的小室中上室多余的液体小心吸掉，每孔中加入100 μL无血清培养基，在培养箱中放置30 min。

4. 接种细胞

a. 将状态良好的细胞进行消化，离心，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1-10×105/ml（需要做预实验确定具体的细胞密度）；

b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培养基，将小室小心放入24孔板内，在上室中加入细胞悬液100 μL-200 μL，放入培养箱中（需要做预实验确定具体的培养时间）。

5. 固定染色、拍照及计数

a. 到时间点后将小室取出，用PBS清洗小室，用棉签轻柔擦去上室细胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20 min，将小室适当风干，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。

b. 将小室置于显微镜下，随机选取5个视野，拍照并计数。

三、注意事项

1. Matrigel使用说明

Matrigel应避免反复冻融，分装时将整瓶Matrigel埋没在碎冰盒中，再将冰盒置于4℃冰箱中，建议放在冰箱靠后的位置，放置过夜，避免使用冰箱门进行解冻，因为其内装物的温度在反复打开时会迅速上升，导致材料过早凝胶化。分装后置于-20℃保存，长期保存可放于-80℃冰箱中；

2. 如何尽量避免增殖对结果的影响

如果在侵袭实验期间发生了大量的增殖，那么计算出的绝对侵袭数据将受到影响。因此，侵袭实验时间越短，增殖对数据的影响就越小。当然，实验中的肿瘤细胞很可能在48或72小时内就会增殖，但如果每个治疗组的增殖量是相似的，允许直接比较治疗组之间的相对侵袭数据；

3. 小室的重复使用

很多实验室会将小室进行重复利用，我们需要在用棉签擦拭时避免用力，避免损伤小室膜，重复利用前应在镜下观察小室膜是否有裂缝。

4. 小室孔径的选择