200kd的大蛋白western blot的实验

A1：首先使用6-8%的分离胶，其次电转时间适当延长，250mA，90分钟左右。如果同时需要跑一些分子量小的蛋白，最好将大小两种膜分开转膜

A2：注意以下问题：1、 缓冲液中加甲醇的作用是使SDS游离出来，并增加膜结合蛋白的量，但过多的甲醇会使胶收缩，造成大分子在凝胶中的沉淀而降低转膜效率。大分子量的蛋白质（如大于60kDa）应使用低浓度的甲醇或不使用甲醇。

2、 电转移效果检查方法：①考马斯亮兰染色电转移后的凝胶，检查是否还有蛋白质存留；②丽春红染色，检查膜是否吸附了蛋白质。

3、 湿式电转方法效率高，半干式电转方法转移速度较快。

4、 阻断剂有BSA、Tween-20、脱脂奶粉和其他动物的血清等多种，阻断的效果不尽相同，如果实验中发现背景过高，可以尝试更换阻断剂。

5、 一抗和酶标二抗的浓度十分重要，浓度过高，造成背景过高；浓度过低造成灵敏度偏低，实验中应根据一抗和酶标二抗的效价，对此参数进行优化。此外，一抗的质量十分关键，抗体特异性和效价直接影响实验结果。

6、 须严格控制假阳性反应，可使用免疫前血清作为阴性对照，同时要以抗原作为绝对的阳性对照，准确确定阳性条带的位置。

A3：6%左右的胶，电泳的话得试一下，80V，先跑半小时，然后100V跑半小时，0.45mm 的PVDF膜，转膜普通转膜液350MA，90分钟左右